螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒

產品簡介：

報告基因系統廣泛應用于真核生物基因表達和細胞生理學研究，包括受體活性、轉錄因子、細胞內信號轉導、mRNA處理和蛋白質折疊等。螢光素酶檢測系統在靈敏度和操作簡易性等方面都比傳統的檢測方法有了很大改進。螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化螢光素底物（luciferin）氧化生成氧化螢光素（Oxyluciferin），在氧化過程中產生生物螢光。傳統的螢光素酶檢測中，酶和底物接觸后，會形成快速衰減的閃光型螢光。美侖螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒（Firefly Luciferase Reporter Assay Kit）有效改善了酶促反應過程的動力學穩定性，螢光強度穩定性可達30s以上，并可達到至少8個數量級的線性檢測結果。該試劑盒可靈敏高效的檢測受基因元件調控的Luciferase表達，通常將轉錄調控元件或5'啟動子區克隆在firefly luciferase的上游，或把3'-UTR區克隆在Firefly luciferase的下游，構建成報告基因(reporter gene)質粒。然后轉染細胞，經給藥刺激等操作完畢后裂解細胞，測定螢光素酶活性。通過螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等操作對目的基因的轉錄調控作用。螢火蟲螢光素酶催化Luciferin發光的最強發光波長為560nm。

數據展示

圖1. 美侖Firefly luciferase螢光強度對比其他品牌。

圖2.美侖Firefly luciferase螢光信號穩定性（動力學）檢測。從反應初始時刻持續追蹤Firefly luciferase螢光信號30s，可以發現美侖組的螢光信號近乎無衰減，信號穩定性極好，遠遠滿足常規機器操作所需時長?。▋x器參數：VILBER/化學發光/-90制冷CCD）

圖3.美侖組Luminescence-Firefly luciferase濃度梯度標準曲線。在儀器（BioTek HTX）允許的最大測試范圍內，美侖Firefly luciferase 螢光線性檢測范圍可達8個數量級，R2可達0.9996?。▋x器：BioTek HTX）

圖4.美侖螢火蟲螢光素酶報告基因檢測試劑盒實際應用舉例。HEK-293T細胞轉染了螢火蟲螢光素酶NF-κB response reporter質粒。轉染后12h，進行TNFα濃度梯度誘導，5h后收集細胞并進行裂解。酶標儀檢測信號讀值，對數據進行歸一化處理，詳見表格。以上結果提示Firefly luciferase 光強與給藥濃度呈正相關，并且反應靈敏度高。（儀器：BioTek HTX）

使用說明：

1.自備材料

 PBS；移液器或排槍；黑色酶標板；化學發光儀或酶標儀，可配自動自動進樣器。

2.檢測前準備

（1）首次使用時將Firefly Luciferase Reaction Buffer一次性全部倒入Firefly Luciferase Substrate瓶中，充分混勻后按使用需求進行分裝并保存于-70℃；

（2）每次使用前以1:4比例將5× Lysis Buffer與ddH2O充分混合，置于冰上備用。配制體積根據實驗需求，建議現配現用。

3.操作方法 
(1)單管檢測方法

1）裂解細胞 
a.貼壁細胞：吸去細胞培養基，用PBS緩慢輕容地洗滌一次，洗去殘留的培養基，然后將液體全部吸棄。懸浮細胞：離心去上清后，清洗細胞一次再次離心收集細胞沉淀。。 
b.按照下表建議加入適量的1×Cell Lysis Buffer，室溫下靜置或振動搖晃裂解15min，吹打并吸取全部細胞裂解產物至1.5ml離心管中，16000g常溫離心5min，取上清用于后續檢測。

注：若螢光素酶的表達水平過低，可適當減少細胞裂解液的使用量以提高蛋白濃度，但需保證裂解液體積可以覆蓋細胞孔板底面否則會影響裂解效果。

2）Firefly Luciferase反應檢測 
小心吸取20uL細胞裂解上清依次加入至檢測管或酶標板中，再加入100uL平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，迅速混勻后立即于化學發光儀或酶標儀中檢測Firefly Luciferase報告基因活性。（注：務必將反應緩沖液恢復至室溫，使酶促反應在最適溫度25℃進行。加樣后，需要進行混勻，使酶促反應充分穩定進行。本品Firefly 螢光穩定性可達30s以上。）

(2)通過自動進樣器進行高通量檢測方法

1）裂解細胞 
a、貼壁細胞：用排槍吸去細胞培養基，PBS緩慢輕柔地洗滌一次，洗去殘留的培養基，然后將液體全部吸棄。懸浮細胞：參考單管檢測細胞收集方法，不適合原位裂解。 
b、以96孔板為例，用排槍每孔加入20uL 1×Cell Lysis Buffer，室溫下靜置或振動搖晃裂解15min。

2）Firefly Luciferase反應檢測 
按照儀器說明書完成自動進樣器的初始化操作，設定自動進樣器1為溶解底物后的Firefly Luciferase Reaction Buffer。設置檢測程序，通過自動進樣器1加入100uL平衡至室溫的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，振板1-2s混勻，檢測Firefly Luciferase報告基因活性。（注：務必將反應緩沖液恢復至室溫，使酶促反應在最適溫度25℃進行。加樣后，需要進行振板混勻，使酶促反應充分穩定進行。本品Firefly 螢光穩定性可達30s以上。）

注意事項：

1、檢測儀器選擇：能夠檢測化學發光的儀器都適用本試劑盒的檢測，但是針對相同的樣品，不同檢測器本底信號值和測量值均可能不同，且對于同一樣本檢測，不同儀器的數值不可橫向比較。為防止孔間干擾，推薦使用黑色酶標板。本產品支持配有自動進樣器的酶標儀，可以更好的減小人為操作時間造成的孔間差異，具體操作請參考配套的自動進樣器說明書。 
2、如果體系中螢光素酶表達量較低，可適當減少裂解用量以提高蛋白濃度，同時應增加檢測復孔的數量，以減少低濃度表達造成的孔間差異，確保結果的可靠性。 
3、酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將細胞裂解產物和檢測底物均平衡至室溫后使用。 
4、為保證螢光素酶檢測試劑穩定性，可采取適當分裝后-70℃冰箱避光保存的方法，以避免反復凍融和長時間暴露于室溫。檢測前根據需要取適量分裝后的反應溶液室溫（25℃）水浴復融，充分渦旋混勻后使用。 
5、裂解產物與Firefly發光反應液接觸后約30s內螢光強度較為穩定，為取得最佳檢測結果，在使用單管的化學發光儀檢測時，不同樣品和底物混合后至上機檢測的時間間隔應盡量一致；使用具有化學發光測定功能的多功能酶標儀時，應先把細胞裂解液在孔內加好，然后采用排槍統一加入檢測底物并盡快上機檢測。 
6、使用配有自動進樣器的多功能酶標儀進行高通量檢測時，注意選擇合適的進樣速度。加入Firefly Luciferase Reaction Buffer應選擇低速模式，避免形成大量氣泡。

保存條件：

全新試劑盒-20℃保存，一年有效；

溶解分裝后的Firefly Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年，或-20℃短期保存不超過一個月。

運輸條件：

 -10℃干冰運輸。

聲明：本產品供科學研究和生產使用，用于組織和細胞的體外培養。禁止臨床使用